Calu-3 Calu-3細胞 atcc標準菌株

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　　Calu-3 Calu-3細胞 atcc標準菌株 傳代保藏過程：

　　3項下標準菌的復蘇為傳*代，復壯為第二代。 傳第三代時取1支凍存管自然解凍，將其轉接斜面菌種作為工作用菌種。此時，工作用菌種為第3代。工作用菌種，分為兩類：一類用于定期傳代(W3)，一類用于實驗用（S3）。

定期傳代用菌的傳代其操作步驟如下（斜面接種法）：

　?。?）從冰箱冷藏室中取出菌種斜面后，應在室溫放置約30分鐘。

　?。?）將裝有新鮮配制的培養(yǎng)基菌種保藏管管壁上注明菌名及接種日期，和傳代菌種一并移入潔凈工作臺，打開紫外燈照射一小時。

　?。?）關閉紫外燈。點燃酒精燈，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅約30秒，隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過三次。

　?。?）右手用無名指、小指及掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉燒灼，右手再輕輕拔開管塞，將接種環(huán)伸入管內先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒并將菌種管口移至火焰上方。　

　?。?）塞上管塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面（或改良馬丁瓊脂斜面）一支，照上述操作打開管塞，將接種環(huán)伸入管內至瓊脂斜面的底部向上劃一條直線，然后從底部向上作連續(xù)曲線劃線，一直劃到斜面頂端，使細菌接種在斜面的表面上。

　　（6）取出接種環(huán)，在火焰上方將培養(yǎng)基管蓋上塞子，然后將接種過細菌的接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。

　　（7）將已接種好的細菌管置30～35℃細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)22 ～24h，真菌管置23～28℃真菌培養(yǎng)箱zui多培養(yǎng)7天。

　　當工作用菌種傳代代數(shù)小于5時，可直接用上一代工作用菌種轉接下一代工作用菌種，如：（W3）可直接轉接為（W4）。按上述程序操作，直至（W4）轉為（W5）為止，需重新接種，舊的工作菌種進行銷毀。

　　基因敲除技術是20世紀80年代發(fā)展起來的，是建立在基因同源重組技術基礎以及胚胎干細胞技術基礎上的一種新分子生物學技術?；蚯贸褪峭ㄟ^同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的的一種技術。本文對三種基因敲除技術作比較，描述它們的優(yōu)缺點。

　　基于胚胎干細胞的同源重組技術　　1、優(yōu)勢：成熟、可靠、精細是目前為止*一個可以滿足所有要求的打靶技術　　2、局限性：　　A 需要ES細胞，目前只有小鼠有的ES細胞，其它模式動物的ESC還不能實現(xiàn)大規(guī)模應用。　　B 周期長、工作量大、費用相對比較高　　3、可提供服務類型：　　A 全基因敲除模式小鼠　　B 條件性基因敲除模式小鼠　　C 先全敲除再條件性敲除模式小鼠　　D 基因敲入模式小鼠

　　E ROSA位點定點轉基因　　TALEN技術　　1、優(yōu)勢：基因敲除效率高，速度快，可實現(xiàn)多物種基因敲除

　　2、局限性：　　基因敲入效率較低，多基因敲除困難，系統(tǒng)構建相對復雜，存在脫靶風險

　　3、可提供服務類型：　　A 全基因敲除大/小鼠　　B 全基因敲除細胞系

　　EGE系統(tǒng)　　1、優(yōu)勢：基因敲除/敲入效率高，速度快，可實現(xiàn)多基因、多物種基因敲除/敲入，系統(tǒng)構建簡單　　2、局限性：　　存在脫靶風險，但通過選擇合適的sgRNA可以有效降低脫靶率，In vivo脫靶可通過傳代去除.　　3、可提供服務類型：　　A 全基因/條件性基因敲除大/小鼠　　B 全基因/條件性報告基因敲除/敲入大/小鼠　C CRISPR/Cas9粒構建　　D 細胞系敲除/敲入

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　　研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質不佳。胎牛血清使用錯誤或胎牛血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于–80℃太久。

　　研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少， 大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

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